La cura mirata dei tumori

I geni umani sono caratterizzati da esoni di piccole dimensioni codificanti le proteine separati da lunghe regioni introniche non codificanti. Durante il processo della trascrizione le sequenze introniche sono rimosse attraverso un processo denominato splicing e gli esoni sono uniti a formare l’RNA messaggero maturo (mRNA)(1). Poiché le giunzioni tra gli esoni e gli introni non sono caratterizzate da una sequenza specifica e conservata il macchinario di splicing, denominato spliceosoma, richiede l’assistenza di molteplici proteine che legano gli RNA, che riconoscendo sequenze sia esoniche che introniche, facilitano e determinano il posizionamento dello spliceosoma sulle giunzioni esone-introne. L’attività antagonista di tali proteine fa si che alcuni esoni, denominati variabili, possano essere inclusi o esclusi alternativamente a seconda del contesto cellulare(2-4). Lo “splicing alternativo” (SA) in questo modo espande la capacità codificante del genoma producendo mRNA differenti e quindi proteine diverse a partire da un unico trascritto genico primario(5). Finalità ed obiettivi Si è ormai accertato che oltre il 95% dei geni umani produce più di una variante di mRNA attraverso SA amplificando così enormemente la capacità codificante. Tuttavia, nonostante che la flessibilità del meccanismo di SA abbia rappresentato una preziosa risorsa genomica durante l’evoluzione, è anche un fattore di rischio. E’ stato dimostrato, infatti, che una larga percentuale di malattie sono causate da difetti proprio dello splicing alternativo. L’obiettvo del presente progetto è quello di studiare alcune condizioni in cui SA può rivestire un ruolo rilevante per la cellula tumorale cercando di identificare delle varianti di mRNA specifici e i meccanismi molecolari coinvolti in questa patologia. In particolare verrà investigato il ruolo di SA nei tumori del sangue o leucemie, quali le sindromi mielodisplastiche (SMD), la leucemia linfatica cronica (LLC) e la leucemia mieloide acuta (AML)(4, 6-9);(10). In questo modo verranno identificati trascritti specifici che potranno facilitare la diagnosi e lo sviluppo di possibili terapie basate sulla correzione degli errori dello SA. La finalita’ del progetto sara’ inoltre quella di “costruire” una banca dati che contiene informazioni sulla maggioranza dei trascritti identificati nelle linee cellulari leucemiche. Questi dati, del trascrittoma, forniranno valutazioni quantitative sui livelli di espressione genica nei tessuti sani e quelli delle cellule leucemiche. Metodi e materiali che si intendono adottare per la realizzazione Il trascrittoma è l’insieme di tutte le molecole di RNA, inclusi RNA codificanti e non codificanti, prodotte nella singola cellula o in una popolazione di cellule. Il metodo del sequenziamento del trascrittoma (RNA-Seq) consiste nel sequenziamento dell’ RNA codificante per proteine (mRNA-Seq) e permette l’identificazione di forme di splicing alternative. Con la tecnologia del RNA-Seq intendiamo analizzare il trascrittoma delle cellule staminali ematopoietiche sane ed una serie di linee di cellule leucemiche al fine di identificare i geni alterati nella loro espressione. In collaborazione con la piattaforma di High Throughput Screening (HTS) allestita presso il CIBIO dell’Universita’ degli Studi di Trento, i dati di RNA-Seq saranno analizzati e quantificati utilizzando i pacchetti software standard (Cufflinks/MISO)(11, 12). Il profilo di AS verrà di cellule staminali ematopoietiche sane verrà confrontato con quello proveniente da una serie di linee cellulari leucemiche e cellule sane del midollo osseo. Sulla base di queste analisi verrano selezionati trascritti di potenziale interesse, valutando ulteriormente il loro ruolo nell’eziopatogenesi delle leucemie. Nella fase successiva ci concentreremo in particolare sugli eventi del SA la cui rilevanza biologica sarà determinata dai nostri esperimenti. Un aspetto critico sara’ quello di identificare gli elementi di sequenza e i fattori che regolano lo splicing alternativo dei trascritti cosi detti “oncogeni”. L’identificazione delle sequenze verrà fatta utilizzando dei minigeni contenenti porzioni differenti dell’esone e delle regioni introniche fiancheggianti. In seguito cercheremo di identificare i fattori che interagiscono con le sequenze rilevanti per la regolazione di questo evento di splicing. Il passo successivo ci permettera’ di identificare tramite saggi di pull down con estratti nucleari i fattori che interagiscono con le sequenze rilevanti per lo splicing alternativo identificati con i minigeni. Da questa analisi ci aspettiamo di isolare e quantificare i gruppi di trascritti con attività anomale nelle cellule cancerogene, le quali successivamente saranno associate con leucemia linfocitica che stiamo studiando. Il risultato che ci aspettiamo di ottenere sara’ un quadro complessivo dei geni la cui espressione è alterata in seguito all’insorgere o durante la progressione della malattia del cancro. Tali geni possono essere utili marcatori o bersagli terapeutici. Ulteriori analisi sararano costituite da una procedura automatizzata per siRNA transfection (cosi’ detto il knockdown della proteina dell’interesse), isolamento del mRNA ed una analisi della RT-PCR multipla seguita dal sequenziamento che ci permetterà di rilevare i fattori determinanti per un particolare evento del splicing alternativo. Questo approccio sarà utile per identificare i regolatori del splicing alternativo importanti per l’iniziazione e la progressione della leucemia. I fattori regolatori candidati saranno poi validati in modo indipendente usando siRNA specifici(13). Applicheremo questo metodo per degli eventi di splicing alternativo la cui rilevanza biologica sarà determinata in esperimenti precedenti.