Valutazione dell’effetto di ELF-EMF su cellule polimorfo nucleate

L’ esposizione ai campi elettromagnetici (EMF) è un fenomeno in costante aumento a causa del crescente uso di energia elettrica, delle nuove tecnologie e di cambiamenti sociali che incrementano l’utilizzo di oggetti che generano campi elettromagnetici. Oltre alle sorgenti naturali, lo spettro elettromagnetico include i campi generati dalle sorgenti create dall’uomo, come ad esempio: impianti realizzati per trasmettere informazioni attraverso la propagazione di onde elettromagnetiche (impianti radio-TV e per telefonia mobile), impianti utilizzati per il trasporto e la trasformazione dell’energia elettrica dalle centrali di produzione fino all’utilizzatore in ambiente urbano (elettrodotti), apparati per applicazioni biomedicali, impianti per lavorazioni industriali, nonché tutti quei dispositivi il cui funzionamento è subordinato a un’alimentazione di rete elettrica (elettrodomestici). Il campo elettromagnetico a frequenza estremamente bassa (Extremely Low Frequency-ElectroMagnetic Fields, ELF-EMF) è caratterizzato da una gamma di frequenza di 1-300 Hz, prodotta per esempio da linee elettriche e apparecchiature elettroniche, piccoli elettrodomestici come aspirapolveri elettrici, forni a microonde, asciugacapelli, etc. Le ELF, così come le radiofrequenze (RF: 100 kHz-300 GHz) vengono identificate come radiazioni non ionizzanti (Non Ionizing Radiation, NIR), definite tali in quanto non trasportano sufficiente energia per ionizzare atomi o molecole; infatti, quasi tutte le agenzie governative che si occupano di salute pubblica, dal National Cancer Institute statunitense, all’Health Protection Agency inglese, fino all’Organizzazione Mondiale per la Sanità hanno stabilito che le radiazioni non ionizzanti non sono dannose per la salute. Tuttavia, molti studi epidemiologici a riguardo dimostrano una stretta correlazione tra EMF e varie patologie (Kurtulus et al,2009), di conseguenza l’International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection (INCIRP) ha fissato dei limiti alla generazione di EMF: 1 mT (milliTesla) per l’esposizione professionale, e 200µT (microTesla) per l’esposizione generale. Anche se questi limiti non sono violati da singoli fonti artificiali, effetti additivi devono essere considerati. Evidenze sperimentali hanno, ormai, accertato che le radiazioni prodotte ELF-EMF causino la produzione di radicali liberi (specie reattive dell’ossigeno, ROS) (Consales et al,2012). L’eccessiva quantità di ROS compromette fosfolipidi di membrana, distrugge la funzione mitocondriale e causa danni a proteine RNA e DNA, fino, potenzialmente, a promuovere il cancro (Geou-Yarh Liou and Peter Storz 2010). I ROS sono un inevitabile sottoprodotto della respirazione mitocondriale ed è necessario un complicato meccanismo di difese antiossidanti per proteggere la cellula. Enzimi come le superossido dismutasi (SOD1, SOD2, SOD3), intervengono per convertire i superossidi in specie inerti e la loro inattivazione è stata collegata a patologie neurodegenerative (Kaur et al,2016) e non solo (Elchuri, et al 2005). Da notare che questi enzimi antiossidanti contengono nel loro sito catalitico rame, zinco o manganese. Quindi, anche piccole alterazioni dell’omeostasi di questi biometalli possono causare malattie infiammatorie croniche quali: patologie neurodegenerative, cardiovascolari, autoimmuni, del tratto gastrointestinale etc (Josko, et al,2011). In particolare, un deficit dei livelli di rame può provocare non solo aumento del danno ossidativo ma una conseguente produzione ridotta di energia, un alterato metabolismo del glucosio e del colesterolo, un aumento del ferro tissutale (Fe), alterare la struttura e la funzione delle cellule del sangue e del sistema immune, causare un’anormale sintesi di neuro peptidi, un’alterata contrattilità miocardica, nonchè risposte neurocomportamentali alterate. E’ da tenere in considerazione che un eccesso di rame, in particolare la frazione libera, cioè non legata a proteine (ceruloplasmina, albumina etc.), può causare lesioni dei tessuti per l’effetto pro-ossidante e l’esaurimento delle riserve antiossidanti. L’esempio più drammatico di sovraccarico di rame è la malattia di Wilson (Bandmann et al,2015), ma l’eccesso di rame è anche associato a preeclampsia, cardiomiopatia dilatativa, infiammazione, ostruzione biliare, malattia di Alzheimer e cancro (McMillin et al,2009). Il nostro obiettivo è quello di valutare il potenziale effetto di ELF-EMF nel promuovere la patogenesi di malattie infiammatorie croniche alterando l’omeostasi del rame e di conseguenza lo stato metabolico delle cellule polimorfonucleate. Il nostro gruppo si avvale di una lunga esperienza nello studio dei meccanismi molecolari correlati all’alterata omeostasi del rame. DESCRIZIONE ANALITICA DEL PROGETTO Numerosi studi hanno evidenziato il ruolo delle ELF-EMF sulle cellule del sistema immune (Tang R et al 2016; Salehi I et al 2013). E’ stato riscontrato che le ELF-EMF incrementano il numero dei granulociti, in particolare dei neutrofili, le cui attività funzionali sono legate al contenuto intracellulare di rame (Stan et al., 2016). Infatti, i neutrofili di pazienti con basso contenuto di rame sierico mostrano una minore capacità fagocitaria o una diminuita attività antibatterica (Djoko,et al., 2015). Il nostro obiettivo sarà di valutare l’effetto delle ELF-EMF sull’omeostasi del rame nei neutrofili e di conseguenza la loro capacità di modulare la risposta delle popolazioni linfocitarie. Cellule polimorfonucleate (neutrofili) e le cellule mononucleate di sangue periferico (PBMCs) saranno isolate da buffy coats provenienti da donatori sani afferenti il centro trasfusionale. In seguito all’isolamento sarà eseguita una caratterizzazione immunofenotipica mediante l’utilizzo del citofluorimetro (FACS) e valuta la concentrazione intracellulare di rame. In seguito, i neutrofili saranno sottoposti a un debole campo magnetico di 50 Hz (densità Tesla da definire), a vari tempi al fine di comprendere se tali variazioni possano comportare un effetto sulla concentrazione del rame intracellulare e quindi sulle loro funzioni rispetto alle stesse cellule mantenute in assenza di ELF-EMF. In contemporanea, i neutrofili saranno messi in co-coltura con le PBMCs al fine di studiare l’effetto immuno- modulatorio e la direzionalità del fenotipo cellulare. Sarà valutata l’espressione genica e proteica dei principali chaperoni e trasportatori del rame: Copper chaperone for superoxide dismutase 1 (CCS), Synthesis of cytochrome c oxidase 1 e 2 (SCO1 e 2), Antioxidant 1 (Atox1), Cu-transporting ATPase 7a e 7b (ATP7A e B), Copper trasporter 1 e 2 (CTR1 e 2). Obiettivo In questo contesto il progetto di ricerca sarà focalizzato sullo studio del ruolo degli ELF-EMF e della disomeostasi di rame nel modulare la risposta immunitaria del soggetto esposto. Investigheremo se l’esposizione a campi elettromagnetici deboli sia in grado, per se, di modulare la risposta immune ed in particolare dei polimorfonucleati, interagendo con la distribuzione di rame intracellulare. Descrizione del progetto Le cellule verranno sottoposte a deboli campi elettromagnetici (ELF-EMF) (da 0 a 50 Hz) per un periodo che andrà da poche ore fino a cinque giorni, grazie ad un apparato (figura 1) che è stato brevettato da membri del nostro gruppo. Il calcolatore che gestisce l’impianto è provvisto di una scheda in/out analogica e digitale DAQCard-6036E di National Instrument con terminaliera schermata. Per la gestione dell’intero processo è stato realizzato uno specifico programma in linguaggio LabVIEW. Gli esperimenti verranno effettuati mantenendo le cellule in coltura ad un’esposizione costante ad un campo magnetico statico (µT-nT) in sovrapposizione ad un campo alternato ELF-EMF (tra 0 a 50 Hz). Frequenze maggiori verranno utilizzate per simulare condizioni di esposizione marcate e presenti in ambienti sanitari e non. In contemporanea, i neutrofili sottoposti alle ELF-EMF saranno messi in co-coltura con le PBMCs e sarà valutato , in seguito all’interazione, l’effetto immuno- modulatorio e il fenotipo cellulare. Alla base del nostro progetto c’è la convinzione che le condizioni di iono-risonanza ciclotronica siano in grado di stimolare risposte informazionali da parte delle cellule. È stato, infatti, ampiamente dimostrato che l’esposizione a campi elettromagnetici risonanti possa sintonizzare le cellule eucariotiche spingendole verso la differenziazione, la maturazione e la proliferazione. ATTREZZATURE DISPONIBILI La proposta progettuale è supportata dalla presenza di un know-how articolato e complementare per la caratterizzazione del meccanismo di azione di campi elettromagnetici deboli (ELF-EMF) sia dal punto di vista molecolare che da quello cellulare. La dotazione strumentale è notevole ed estremamente variegata. Gli istituti coinvolti, ossia l’Istituto di Biologia e Patologia Molecolari (IBPM) e l’Istituto di Farmacologia Traslazionale (IFT), possiedono un’ampia gamma di strumentazione utile allo sviluppo della proposta. Entrambi gli istituti sono dotati di camere per la coltura cellulare fornite di diverse cappe a flusso laminare, incubatori in grado di mantenere le condizioni adeguate alla crescita cellulare (umidità controllata, temperatura di 37 °C ed un livello di CO2 del 5%) e microscopi per la visualizzazione sia in campo chiaro che in fluorescenza. In particolare, l’IBPM ha anche sviluppato con successo metodologie di imaging avanzato, anche in collaborazione con Nikon Italia, di cui è Centro di riferimento per l’Italia Centro-Sud, integrandole alla sua consolidata tradizione sperimentale in genetica e biologia molecolare e cellulare. L’ IFT, invece, è in possesso di un apparato, brevettato da membri del partenariato, utile allo studio degli effetti degli ELF-EMF sulle colture cellulari che comprende una camera schermata dalle radiazioni non-ionizzanti ambientali, al cui interno è posto un incubatore adatto alle colture cellulari circondato da un solenoide in grado di emettere campi elettromagnetici. La strumentazione utile allo studio dell’impatto degli ELF-EMF si completa con un sistema analitico per il controllo della temperatura e della forza del campo generato in grado di rendere i risultati ottenuti dalla sperimentazione estremamente ripetibili. L’IBPM è all’avanguardia nello studio della regolazione dell’espressione genica. La strumentazione, di conseguenza, è perfettamente adeguata allo sviluppo dello studio dell’impatto sul metabolismo, come testimoniato anche dalle pubblicazioni scientifiche del responsabile scientifico. Il gruppo è in possesso di strumenti per le indagini a livello molecolare e proteico quali apparati per PCR e Real-Time PCR (7500 Fast Real-Time PCR System della Life Technologies) apparati per il Western Blot nonché lettori di micropiastre per i saggi Elisa e citofluorimetrici (BD LSRFortessa™ cell analyzer) di ultima generazione. Ai fini dello sviluppo del progetto, di estrema rilevanza è lo spettrometro per assorbimento atomico PerkinElmer PinnAAcle 900Z equipaggiato con fornetti di grafite, un auto-campionatore ed un magnete per sfruttare l’effetto Zeeman, che aumenta notevolmente la sensibilità di rilevamento. L’assorbimento atomico è il gold-standard per la valutazione di atomi in campioni biologici e lo strumento PinnAAcle 900Z è quanto di più innovativo ci sia a riguardo. È controllato da un software disegnato specificamente per lo strumento, il Syngistix. Tale tecnica si basa sulla proprietà dei metalli di assorbire la luce quando vengono atomizzati e poi colpiti da una radiazione luminosa. Gli spettri atomici sono specifici per ciascun metallo. Nel fornetto di grafite, il campione va incontro a tre fasi successive: una fase di evaporazione per togliere l’acqua, una fase di incenerimento, dove viene eliminata tutta la fase organica, ed una ultima fase di atomizzazione nella quale il metallo viene portato allo stato fondamentale di atomo. Queste fasi sono ottenute mediante il progressivo aumento della temperatura nel fornetto, che raggiunge anche 2500 °C, che è specifica per il metallo da analizzare. A questo punto la nube di atomi allo stato fondamentale che si è formata viene attraversata da luce emessa da una lampada specifica per il metallo in esame e la quantità di radiazione assorbita è proporzionale alla concentrazione del metallo stesso. La strumentazione in possesso del partenariato è quindi in grado di garantire la realizzazione del disegno sperimentale proposto. RICADUTE APPLICATIVE E POTENZIALE IMPATTO DEI RISULTATI L’esposizione a ELF-EMF potrebbe causare non solo danno, ma, come già descritto in alcuni sistemi (tessuto osseo e cardiaco), potrebbe avere un effetto biologico positivo sulla rigenerazione tissutale. Le conoscenze che otterremo con il nostro progetto di ricerca ci permetteranno di ottenere informazioni utili riguardo all’impatto degli ELF-EMF sulla risposta immune. Inoltre, i nostri dati permetteranno di capire come e se i deboli campi elettromagnetici siano in grado di alterare l’omeostasi di metalli (rame )coinvolti nella omeostasi cellulare. Riteniamo che l’attenta valutazione del rischio/beneficio degli ELF-EMF sulla risposta immunitaria, e la caratterizzazione degli eventi molecolari, potrebbe essere alla base dello sviluppo di strategie terapeutiche innovative, utilizzabili in Medicina Preventiva. Inoltre, le nuove conoscenze permetteranno di istituire programmi per informare non solo il lavoratore, ma anche il cittadino di eventuali effetti nocivi e/o protettivi propri degli ELF-EMF. FATTIBILITÀ/CRITICITÀ DELLE SOLUZIONI PROPOSTE Il partenariato che propone la proposta progettuale è caratterizzato dalla presenza di un know-how articolato e complementare per la caratterizzazione del meccanismo di azione di campi elettromagnetici deboli (ELF-EMF) sia dal punto di vista molecolare che da quello cellulare. I due Istituti coinvolti (IBPM e IFT) sono in possesso dell’ampia gamma di strumentazione utile allo sviluppo della proposta. Inoltre, gruppi partecipanti hanno stabilito da diversi anni conoscenze approfondite ed expertise da una parte sui campi elettromagnetici a bassa frequenza, dall’altra sulla regolazione a livello molecolare del metabolismo delle cellule del sistema immune, caratterizzandone il coinvolgimento nella modulazione dell’energia mitocondriale. Attualmente si stanno già studiando alcuni dei punti indicati nel progetto, come, ad esempio, la modulazione del rame in corso della risposta immunitaria innata. PRODOTTI ATTESI E LORO TRASFERIBILITÀ Nel suo complesso il progetto potrà generare, già a breve termine, importanti risultati quali: a) la standardizzazione di protocolli per lo studio del ruolo degli ELF-EMF sulla risposta immunitaria. b) l’dentificazione e la validazione delle pathways intracellulari coinvolte. c) la caratterizzazione e la delocalizzazione intracellulare del rame e dello zinco nella modulazione della risposta immune in presenza di ELF-EMF. I risultati ottenuti saranno pubblicati su riviste internazionali ad alto impatto. Convegni, seminari e workshops saranno organizzati per sensibilizzare la comunità scientifica alla problematica dell’inpatto degli ELF-EMF sulla salute dell’uomo, ed in particolare sulla risposta immunitaria. Si organizzeranno anche eventi formativi e divulgativi, in modo da rendere edotto il cittadino.